正式實驗時，應別離以陽性對照與陰性對照控制實驗條件，待檢樣品應作一式二份，以確保實驗成果的準確性。有時本底較高，闡明有非特異性反響，可選用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
實驗條件的挑選
在ELISA中，進行各項實驗條件的挑選是很重要的，其間包括:
(1) 固相載體的挑選：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。現在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反響，調查其顯色反響是否均一性，據此判明其吸附功能是否杰出。
(2) 包被抗體(或抗原)的挑選：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時刻及其蛋白量也有必定影響,一般多選用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后，在其它實驗條件相同時，調查陽性標本的OD值。挑選OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于大都蛋白質來說一般為1～10μg/ml。
(3) 酶符號抗體作業濃度的挑選：首先用直接ELISA法進行開始效價的滴定(見酶符號抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參閱品及酶符號抗體別離為不同的稀釋度)在正式實驗系統里準確地滴定其作業濃度。
(4) 酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選要求是價廉、安全、有明顯地顯色反響，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌效果，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是現在較為滿足的供氫體。底物效果一段時刻后，應加入強酸或強堿以終止反響。一般底物效果時刻，以10-30分鐘為宜。底物使用液有必要新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前加入。