1. 正式試驗時，ELISA試劑盒應分別以陽性對照與陰性對照操控試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以確保試驗結果的性。有時本底較高，闡明有非特異性反響，可采用羊血清、兔血清或BSA等關閉。
2. 在ELISA中，進行各項試驗條件的挑選是很重要的，其間包括：
① 固相載體的挑選：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。現在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在運用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一試驗條件下進行反響，觀察其顯色反響是否均一性，據此判明其吸附功能是否杰出。
 ② 包被抗體(或抗原)的挑選：將抗體(或抗原)吸附在固相載體外表時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時刻及其蛋白量也有必定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被后，在其它試驗條件相一起，觀察陽性標本的OD值。ELISA試劑盒挑選OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。關于多數蛋白質來說一般為1～10μg／ml。
③ 酶標記抗體作業濃度的挑選：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參閱品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式試驗體系里地滴定其作業濃度。
 ④ 酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選要求是價廉、安全、有明顯地顯色反響，而自身無色。有些供氫體有潛在的致癌效果，ELISA試劑盒應留意防護。有條件者應運用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是現在較為滿意的供氫體。底物效果一段時刻后，應加入強酸或強堿以停止反響。一般底物效果時刻，以10-30分鐘為宜。底物運用液有必要新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
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