病毒RNA快速提取試劑盒的應用

背景[1-3]

病毒RNA快速提取試劑盒是一種基于離心柱法從含病毒的血漿、血清、體液、拭子及細胞及其培養上清、組織等樣品中安全、快速、便捷、穩定、高效、高質量地抽提長度大于200個核苷酸(nucleotide,nt)的病毒RNA的試劑盒。抽提獲得的大于200個核苷酸的病毒RNA樣品(可能同時含有樣品中的其它RNA)可以用于各種常規用途。

本試劑盒抽提得到的病毒RNA可用于qRT-PCR、反轉錄、RT-PCR、qPCR、Northern、點雜交(Dot Blot)、純化mRNA、體外翻譯、RNase protection assay、cDNA克隆等下游實驗；也可用于基因表達芯片分析(microarray)、高通量測序(high throughput sequencing)等對RNA質量要求較高的情況。

病毒RNA快速提取試劑盒

樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA，然后讓RNA特異性地結合到純化柱上，而蛋白質等其它組分通過高速離心被有效去除，再通過3次洗滌充分去除非特異性結合的蛋白、鹽等雜質，后用洗脫液將高純度的RNA洗脫下來。

本試劑盒適用于含病毒的血漿、血清、體液、拭子及細胞及其培養上清、組織等樣品中病毒RNA的抽提，為提高病毒RNA的提取量，建議自備carrier RNA。Carrier RNA一方面可以提高微量病毒RNA在純化過程中與純化柱的結合效率和洗脫效率；另一方面可以降低被可能存在的痕量殘留RNase降解的風險。Carrier RNA在病毒含量較少的情況下效果更為明顯。Carrier RNA推薦Carrier RNA(病毒RNA等抽提用)。

病毒RNA快速提取試劑盒的應用

用于用于病毒核酸快速提取的新型磁性納米材料的設計、制備和應用研究

通過合成不同表面化學修飾的四氧化三鐵磁性顆粒,并分析磁性顆粒與核酸（DNA和RNA）之間的吸附與解吸附性質,進而建立基于磁性顆粒的病毒核酸提取方法,結合實時熒光定量PCR技術,實現病毒的靈敏、快速檢測。

主要內容及工作結果歸納如下：

（1）利用高溫裂解法和熔劑熱法合成粒徑大小分別為10和200 nm左右的四氧化三鐵磁性顆粒。在此基礎上,首先利用四乙氧基硅烷修飾10 nm四氧化三鐵磁性納米顆粒,合成二氧化硅包裹的磁性顆粒（Silica-coated magnetic particles,SMPs）,從而改善磁性顆粒在水溶液中的分散性,獲得表面帶有負電的磁性顆粒；另外,依次利用四乙氧基硅烷和γ-氨丙基三乙氧基硅烷修飾200 nm的四氧化三鐵磁性顆粒,合成氨基硅烷化磁性顆粒（Aminosilane-modified magnetic particles,AMPs）;后,利用羧基苯硼酸對10 nm四氧化三鐵磁性顆粒進行功能化修飾,獲得羧基苯硼酸修飾的磁性納米顆粒（Carboxyphenylboronic acid-functionalized magnetic particles,CPBA-MNPs）。磁性顆粒的表征結果表明,成功合成了上述不同表面化學修飾的磁性顆粒,其表面基團分別為：羥基、氨基和苯硼酸。

（2）以鮭魚精DNA和大腸桿菌RNA為材料,分析SMPs與核酸的吸附和解吸附性質。結果表明：在低濃度異硫氰酸胍（1.0 M）溶液中,SMPs對核酸的吸附量大；Langmuir吸附等溫線擬合分析表明,1 mg SMPs對DNA和RNA的大吸附量分別為10.6μg和7.6μg；溶液的酸堿性質對于吸附量具有較大的影響,在酸性條件下,能夠顯著降低核酸與SMPs間的靜電斥力,從而提高核酸吸附量；乙醇與異丙醇的加入能夠降低吸附體系的極性,從而增加核酸的吸附量。CPBA-MNPs與核酸之間的吸附與解吸附性質分析結果表明：二價陽離子（如Ca2+、Mg2+）以及乙醇的加入能夠顯著提高核酸吸附量；在酸性條件下,RNA的吸附量大于在堿性條件下的吸附量；由于苯硼酸分子與RNA之間形成了可逆的環酯結構,通過加入順式雙醇類似物可有效地將RNA洗脫,Tris-EDTA溶液（50 mM Tris,5 mM EDTA,pH 8.8）的洗脫效率分別為75.6±7.6%（DNA）和60.1±5.9%（RNA）。

（3）在研究SMPs與核酸吸附與解吸附性質的基礎上,以SMPs為吸附材料,分析提取血清中乙肝病毒和丙肝病毒核酸的可行性,以及利用實時熒光PCR/RT-PCR實現對乙肝病毒和丙肝病毒的快速檢測。結果表明：在蛋白酶K和1.0 M異硫氰酸胍存在的條件下,56℃水浴15 min能夠有效的釋放HBV和HCV的核酸；通過加入1倍體積乙醇,能夠有效的分離提取HBV和HCV的核酸；建立HBV和HCV的實時熒光PCR/RT-PCR檢測方法和定量標準曲線能夠有效的應用于HBV和HCV的檢測與定量。利用實時熒光PCR/RT-PCR技術定量分析SMPs的核酸回收效率分別為30±11.1%（HBV）和34±7.3%（HCV）,高于已報道的商業試劑盒的提取效率。此外,將上述方法應用于進出北京口岸旅行人員的乙肝與丙肝病毒的檢測與分析,結果表明,SMPs方法和實時熒光PCR/RT-PCR方法能夠有效地用于出入境人員的病毒核酸提取和分析工作中。

（4）以SMPs為固相吸附載體,建立提取植物病毒核酸的方法,并應用于植物病毒（南芥菜花葉病毒、百合無癥病毒）及類病毒（啤酒花矮化類病毒、葡萄黃斑類病毒1）的檢測。利用體外轉錄合成覆蓋實時熒光RT-PCR擴增區的RNA標準品,構建標準曲線。結果表明,標準曲線覆蓋6-7個數量級,并且-低檢測限為100拷貝／反應。為評價SMPs方法的核酸提取效率,將體外轉錄合成的RNA標準品加入到植物樣品裂解液中,分別利用SMPs方法、TRIzo1和RNeasy Plant mini kit回收提取。結果表明,在回收百合葉片樣品中的核酸時,SMPs方法與兩種商業試劑盒相等,無明顯差異；而當回收葡萄葉片中的核酸時,SMPs方法的回收效率高商業試劑盒2-3倍。利用SMPs方法分別提取15株感染LSV和15株感染ArMV的百合樣品,利用實時熒光RT-PCR進行檢測。對于檢測ArMV,SMPs方法與其他方法沒有明顯統計學上的差異,而對于檢測LSV,結果略有不同。同TRIzo1相比,SMPs方法具有相同的病毒載量數量級,而與RNeasy Plant mini kit相比,SMPs方法的平均病毒載量低0.51oglo。利用SMPs方法提取19株葡萄樣本的核酸,采用實時熒光RT-PCR方法進行HSVd和GYSVd-1篩查。