1 標本的采取和保存
    可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血清、尿液），有些則需經預處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。
    血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
    2 試劑的準備
    按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
    3 加樣
    在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。
加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。
    4 保溫
    在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當。
    ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
    溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成zui多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。
    保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
    5 洗滌
    洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
    洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下：
    （1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。吸干應*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
    （2）流水沖洗式 流水沖洗法zui初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為*，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。